窦蒙家, 李晓莹 ，饶伟 *
低温生物医学工程学北京市沉点尝试室 ，中国科学院理化技术钻研所低温生物医学是钻研低温与生物体相互作用法规及其医学利用的学科。目前 ，低温生物医学利用重要涉及低温保留及低温医治两方面（图 1）。其中 ，低温保留是指将生物资料（如细胞、组织、器官）在增长低温 ；ぜ恋那榭鱿吕淙粗恋臀拢ㄍǔＮ -196 ℃ 液氮）进行保留 ，待必要时再将其以有效的方式复温至正常温度（37 ℃） ，此时生物样品仍可复原并维吃熹活性。低温医治则是以微创染指的方式将探针插入肿瘤组织 ，手术起头后探针内部冷介质在探针头部与肿瘤组织进行冷量互换 ，使肿瘤组织处于低温环境 ，冰球齐全覆盖肿瘤组织（≤-20 ℃）并维持一段低温医治功夫 ，以达到杀死肿瘤细胞的主张 ，手术实现后取出探针 ，肿瘤原位消解。
图 1 低温保留及低温医治示意图 [1][2]
1、凝固时光的技术——低温保留
在低温下 ，生物体新陈代谢的速度大大降低（图 2） ，进入「生理机造暂停」的状态 ，同时有效躲避了表界滋扰 ，为「无期限」保留创造了前提 ，因而低温保留能使生物资料得以持久安全保留。通常来说 ，样品保留的温度越低 ，保留的功夫就越长 ，在 4 ℃ 时存活功夫只罕见幼时的生物样本 ，在 -80 ℃ 下能够保留数月 ，在 -196 ℃ 下 ，随着反映速度近乎于 0 ，能保留数个世纪。目前 ，低温保留技术是生物资料持久保留的唯一可行蹊径。
图 2 生物样品低温保留的功夫与温度之间的关系
植物细胞—保留功夫极其长：植物种子由于含水量极度低 ，冷冻过程冰晶粉碎作用很幼 ，因而能够持久保留。在植物种子的持久保留上 ，低温保留提供了必不成少的技术支持 ，拥有省事、省工、省用度的特点 ，尤其适合持久保留宝贵罕见种子。一位俄罗斯科学家利用三万年前冰冻在西伯利亚科雷马河永冻层里的种子 ，成功造就出一棵植物 ，突破复苏最古老植物种子的纪录（图 3） ，事实上正是低温环境使得该物种的遗传物质得以齐全的保留 ，援手这枚种子安全度过三万年的休眠期。在挪威斯瓦尔巴特群岛上 ，有一个全球最大的植物末日种子库（图 4） ，以防因全球物种迅速缩减而造成物种灭绝 ，被称为「世界末日」地球资源的诺亚方舟。
图 3 俄罗斯科学家复苏三万年前的种子 [3]
图 4 挪威植物末日种子库 [4]
动物细胞—部门生殖细胞已经实现较长功夫保留：在新兴的医学前沿领域 ，利用现代低温保留技术 ，人类精子、卵子及胚胎持久保留已成为现实（图 5）。1983 年 ，世界首例「冷冻宝宝」诞生 ，人类胚胎低温保留技术逐步发展成熟 ，低温保留技术逐步成为辅助生殖技术中不成或缺的沉要技术之一。2017 年岁暮 ，美国冷冻了 24 年的胚胎宝宝诞生 ，突破了保留最久冷冻胚胎成功出产的世界纪录。现代胚胎保留是将胚胎和低温 ；ぜ磷叭胱ㄓ玫睦涠彻苤 ，通过急剧冷冻（玻璃化保留）的步骤使胚胎浸入 -196℃ 的液氮中 ，削减代谢从而得以保留。目前 ，不变的高新生率胚胎冷冻技术依然是钻研人员钻营的指标 ，这将为不孕不育患者保留生育能力、一连性命提供基础技术支持。除此之表 ，各类生物样本库（如生殖样本库、疾病样本库、中华民族生物样本库及干细胞库等）的建设 ，为保留各类人类资源都起到了沉大作用。
图 5 低温保留辅助生殖技术 [5]
组织器官—目前少数器官实现了短期保留：对于器官移植 ，临床上目前多选取短期低温保留或延时保留技术（4℃ 左右） ，但器官的冷缺血耐受功夫（不侵害器官结构职能的前提下 ，从搁置在低温环境到正 ８丛┑墓Ψ颍┙隙 ，心肺为 4 幼时 ，肝、肠、胰腺为 8～12 幼时 ，肾最长为 36 幼时 ，但其职能细胞 - 肾幼球耐受功夫只有不到 24 幼时。这导致了目前临床上超过 70% 的心脏移植手术由于评估和匹配所需功夫超过了保留限度而被烧毁。我国每年必要进行肾器官移植的人约有 30 万 ，但现实只有 2000 多人能实时获得适配器官接受手术。因而面对器官库欠缺以及可用率低的问题 ，最有效的解决规划就是追求器官持久有效的低温保留步骤 ，目前这一方向仍是全球挑战性的沉大难题。活性物质—低温保留赋能其宽泛利用：在抗击新冠病毒的医疗领域 ，低温保留技术也阐扬了沉要的作用。由于分歧疫苗有着分歧的储运前提 ，这给冷链贮存带来巨大挑战 ，其中抗击新冠疫情的 mRNA 疫苗 ，对低温储运的要求极为严格（图 6） ，必要动态的深低温储运环境。针对分歧的疫苗储运 ，目前已造订了尺度的保留流程 ，为新冠疫苗的冷链输运提供坚实的技术支持。
图 6 新冠病毒疫苗低温保留参数 [6～10]
低温保留技术历经数十年的发展 ，在尝试步骤上获得了巨大成功 ，出格是近几十年来 ，利用低温保留技术 ，已成功地实现了对绝大无数种类细胞的保留 ，在皮肤、角膜等单一组织的低温保留上也获得了肯定进展 ，并在组织再生及器官移植中得到宽泛利用 ，极大地推动了临床医学的发展。器官甚至是活体的保留挑战仍在推动着这一领域的向前发展。
2、杀灭肿瘤的利器——低温医治
早在古埃实时期 ，人们就通过冷敷来减轻炎症 ，低温的医治作用已被发现。近世纪以来 ，战场上 ，医护人员利用低温减轻肢体手术的疼痛。而近年来 ，低温对于医治肿瘤、减缓癌症发展的作用也逐步被人们意识。
低温医治肿瘤（图 7） ，通常是以一种微创的方式将冷冻探针直接插入到肿瘤部位 ，并利用造冷技术在探针针头实现可控的降和善升温职能。在冷冻过程中 ，探针周围会形成冰球 ，使肿瘤组织温度低至 -20 ℃ 以下 ，通过探针持续不休地冷冻、解冻病灶 ，产生一系列不成逆危险 ，达到解除病灶的主张。与其他医治方式相比 ，低温手术由于拥有影像可视、麻醉镇痛、止血或削减出血、手术创口幼以及能预防肿瘤扩散蹬着点 ，并且其副作用远低于放疗和化疗 ，因而在肿瘤医治方面赢得了「绿色疗法」之誉。低温表科手术已拓展利用到险些所有的实体肿瘤医治 ，被学术界和医学界公以为是一种医治肿瘤的沉要步骤。
低温医治癌症成效显著 ，复发率低。早在 1961 年 ，美国医生 I. S. Cooper 就初次使用液氮冷刀 ，获得了优良的医疗成效。2002 年 ，日本庆应大学医学院利用低温医治 42 例晚期肝癌患者 ，肿瘤的齐全消融率达到了 92.2%。2004 年 ，密歇根大学综合癌症中心报路了冷冻消融直径 ≤ 1 cm 的浸润性乳腺导管癌 ，冷冻消融成功率为 100%（27/27）。2017 年 ，美国钻研人员在学术期刊 JVIR 上颁发了一组关于低温医治肾癌的临床数据 ，共 302 名肾癌患者接受了低温医治手术 ，32 个月后 ，肿瘤的复发率仅为 3.2%。
低温医治癌症蓬勃发展 ，对于癌症患者来说 ，不仅仅是医治上有了新的越发低疾苦的选择 ，更是带来了生的但愿。临床上 ，对各种类型的早中晚期恶性实体瘤（好比肝癌、肺癌、乳腺癌等）患者 ，均可采取低温医治方式。出格是对于那些失去了通例手术医治机遇的晚期患者、转移患者、春秋大或身段虚弱患者、不愿意进行通例手术的患者 ，低温医治癌症为他们提供了生的但愿。
随着低温表科手术（也被称为冷冻医治）在恶性肿瘤医治中令人鼓励的大量成功利用 ，肿瘤微创冷冻医治逐步成为低温生物医学技术在现代临床实际中阐扬沉大关键性作用的一个范例（图 8）。以中国为例 ，经过短短十余年的急剧发展 ，目前全国已罕见百家医院 (如北京大学肿瘤医院、复旦肿瘤医院、北京中医药大学东方医院、中国人民解放军总医院等) 发展肿瘤冷冻医治业务 ，并呈急剧增长趋向 ；而在美国 ，发展冷冻医治的医院已超过 450 家 ( 如 MD Anderson Cancer Center, Mayo Clinic, Mountain Sinai Hospital 等）。最近几年 ，全球多个区域还纷纷成立冷冻医治学会 ，旨在推动这一新型高效肿瘤疗法的钻研和利用。不难看出 ，国内表医学界对肿瘤冷冻医治技术拥有宽泛而火急的沉大需要。
图 8 复合式低温冷冻肿瘤微创医治系统康博刀用于临床医治肿瘤 [16]
3、低温双刃剑：默默无闻的 ； or 所向披靡的粉碎？
低温保留与低温医治都是通过低温来实现 ，那么两者之间有什么差距呢？到底两者若何分辨呢 ，又若何确保各自的成效呢？
低温保留与低温医治拥有类似的操作流程：执行降温使生物样本处于低温环境 ，再通过复温使生物样本处于常温环境中。是否增长低温 ；ぜ粒涸诘臀卤Ａ艄讨 ，必要借助资料和技术的伎俩 ，削减相变过程中冰核的形成、抑造冰晶的成长和沉结晶的出现（图 9）。对于绝大部门哺乳动物有核细胞的低温保留来说 ，在同样的降复温前提下 ，是否增长低温 ；ぜ辆龆舜笪奘镅吩诘臀孪虏氖潜 ；ぷ饔没故欠鬯樽饔。无论低温保留降温速度快慢若何都必要增长肯定浓度的低温 ；ぜ晾丛し赖臀挛Ｏ ，而低温医治则不会增长 ；ぜ燎冶匾炕У淖饔。
图 9 低温保留与低温医治差距性
由于生物样本中大部门成分为水（超过 70%） ，所以节造冰晶的形成及成长对于低温保留功至关沉要 ，通过选择相宜的低温 ；ぜ聊芄皇迪直У某沙さ骺 ，那么 ，通常情况下应该若何选择呢？通过增长抑冰资料（低温 ；ぜ粒├吹鹘诒С珊撕徒谠毂沙ず妥刺羌瓤尚械孽杈叮ㄍ 10）。1949 年 ，英国生物学家 C. Polge 和 A. U. Smith 无意发现甘油能够援手精子经历低温冷冻而不殒命 ，使低温 ；ぜ磷魑臀卤Ａ舻囊桓龀烈暄蟹较虻巧虾骨辔杼。低温 ；ぜ聊芄辉直 ；ど镅久馐艿臀挛Ｏ ，在细胞冻存中常被配造成肯定浓度的溶液 ，其能够通过削减冰形成量来削减细胞脱水。低温 ；ぜ猎诮档捅纬伤俣确矫娌⑼蛊。低温 ；ぜ寥缍嘣己吞 ，出格是海藻糖和蔗糖 ，甚至能够代替与其结构有关的水 ，并预防变性或相变 ，以 ；つず偷鞍字拭庥诶涠称诩涞母稍镉。在低温保留规划的设计中 ，选择相宜的低温 ；ぜ磷楹 ，优化低温 ；ぜ恋呐ǘ榷杂谏镅镜臀卤Ａ舫尚У挠跋旒却。
图 10 低温保留剂对于抑造冰晶形成、成长、及建饰冰晶描摹的作用
降温 / 升温参数分歧：分歧的降温及升温速度导致的细胞粉碎力分歧（见图 11）。在增长低温 ；ぜ两斜 ；さ幕∩ ，针对分歧细胞优化低温保留的降和善复温参数能够提高细胞存活率。相宜的降温速度有助于维持冰晶危险与溶液危险之间的平衡（如图 11 所示） ，对于通常的哺乳类细胞 ，降温速度时时选取 1 ℃/min ；而在升温过程中 ，必要比力快的升温速度 ，同时需节造复温温度在细胞热危险温度之下 ，样品从 -196 ℃ 液氮中取出放到 37 ℃ 水浴中急剧复温 ，这个过程通常节造在 1～2 min。在低温医治过程中 ，探针左近的组织降温速度较快 ，通常是 47～116 ℃/min ；升温速度也非？ ，从 -196 ℃ 到 80 ℃ 的加热循环通常节造在 2 min 之内 ，迅速在深低温及高温之间切换时组织产生的扰爪力所造成的机械危险对肿瘤细胞产生了致命的粉碎。值得指出的是 ，当降温速度足够快时（好比 ，纯水的临界降温速度为 3×108 ℃/min） ，能够实现低温玻璃化保留（如图 11a） ，但目前的低温医治设备远低于这个速度 ，只能起到低温粉碎作用。
除了起落温速度分歧 ，低温保留和低温医治的冻融循环次数也分歧。低温保留是为了让生物样本在低温下维持低代谢甚至是零代谢状态 ，为了降低冰晶对生物样本的危险在低温保留中往往只有一次冻融循环。而低温医治 ，凭据必要能够对肿瘤组织进行屡次冻融 ，以加强对肿瘤组织的粉碎性。Whittaker 对仓鼠口腔粘膜进行了反复冻融 ，发现细胞内冰晶会在每次冻融循环的距离中增长。所以 ，为了粉碎肿瘤组织 ，必要急剧冷冻组织 ，并进行反复冻融。
图 11 分歧降温及升温速度下的细胞危险曲线
低温作用对象尺度分歧：低温保留目前能够实现血细胞、悬浮细胞液、卵母细胞等细胞尺度样品的成功冻存 ，对于 1 mm 以下的单一职能生物样本如皮肤、角膜等也能够实现较高的存活率 ，但是 ，目前最为先进的低温保留技术对于 1 mm 以上的复杂生物样本（蕴含血管与多种异质细胞）仍存在严格挑战 ，而对于低温医治的肿瘤组织 ，直径通常都在 5 mm 以上 ，弘远于低温保留对象尺度。由于随着生物样本体积增大 ，传热速度不均匀性增大 ，以及冰晶形成开释大量潜热 ，大尺度生物样本的均温一向是个难题。温度的不均匀性及组织各向异性等引起热膨胀不均匀 ，会造成严沉的扰爪力。当热机械应力超过生物组织极限时 ，就会造成生物样本的永远性危险。
4、未来：低温保留——无冰共生 ，低温医治——遇冰皆消
在低温保留领域 ，目前对于一些单一的细胞 ，已经可能实现比力梦想的冻存新生率 ，但是对于复杂的多细胞生物系统 ，如大尺度组织、器官 ，甚至是复杂的性命活体的低温保留仍有待于破解 ，低温对于大尺度生物样性子命周期的拓展深深吸引着钻研人员确把稳。在低温医治领域 ，因诸多活体成分造约 ，若何确保复杂生理环境下肿瘤的适形化消融 ，在精准杀灭肿瘤组织的同时最大化 ；そ】底橹统烈鞴 ，以达到最优化医治成效 ，依然是低温医治技术钻研的重要方向。
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引用
[1] https://www.sohu.com/a/78964231_257870
[2] https://www.163.com/dy/article/DUQF20150514QIFJ.html
[3] http://news.sina.com.cn/c/2012-02-22/184923974981.shtml
[4] https://www.sohu.com/a/216071699_100068111
[5] https://www.sohu.com/a/342740870_120280712
[6] http://baijiahao.www.kmmcw.com/s?id = 1685015835025447868&wfr = spider&for = pc
[7] https://www.sohu.com/a/483439375_121124452
[8] https://www.chinaabk.com/news/show-73470.html
[9] https://www.sohu.com/a/442038690_114778
[10] https://www.163.com/dy/article/G9DJ8IAA0515CG74.html
[11] https://bbs.iiyi.com/thread-1863549-1.html
[12]http://www.hxkfh.com/zuixindongtai/20170515100306-1918.html
[13] https://www.drmed.cn/Kidney-cancer/treatment
[14] http://m.fuda120.com/patientinfo/mnxtzl/325.html
[15] http://www.hxkfh.com/zuixindongtai/20160118171324-1421.html
[16]http://tv.cctv.com/2021/05/10/VIDEawZy62vbda3yZ3 h3BSBi210510.shtml
